南京地下鐵道有限責(zé)任公司運(yùn)營(yíng)分公司是負(fù)責(zé)南京地鐵運(yùn)營(yíng)工作的實(shí)體，隸屬于南京地下鐵道有限責(zé)任公司。運(yùn)營(yíng)分公司是模擬市場(chǎng)化運(yùn)作，內(nèi)部獨(dú)立核算的企業(yè)，公司根據(jù)“適應(yīng)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)要求，產(chǎn)權(quán)清晰、權(quán)責(zé)明確、政企分開(kāi)、管理科學(xué)”的現(xiàn)代企業(yè)制度要求，實(shí)行總經(jīng)理負(fù)責(zé)制，設(shè)有客運(yùn)部、車(chē)輛部、物資設(shè)施部、票卡清分部、財(cái)務(wù)審計(jì)部、勞動(dòng)人事部、企業(yè)管理部、教育培訓(xùn)部、技術(shù)部、安全保衛(wèi)部、辦公室（黨政合署）等職能部門(mén)，各部門(mén)分工協(xié)作，全面承擔(dān)著公司的運(yùn)營(yíng)和管理工作。另設(shè)有站務(wù)中心、乘務(wù)中心、票務(wù)中心、控制中心、檢修一中心、檢修二中心、設(shè)備中心、工務(wù)中心、通號(hào)中心、供電中心、物資中心、信息中心、機(jī)電和自動(dòng)化中心等13個(gè)中心，中心下面還按照專(zhuān)業(yè)設(shè)有工區(qū)，具體負(fù)責(zé)運(yùn)營(yíng)一線的客運(yùn)、車(chē)輛、設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)等各項(xiàng)工作。運(yùn)營(yíng)分公司一號(hào)線編制人員998人，為接管二號(hào)線、一號(hào)線南延線和二號(hào)線東延線，至2009年底，運(yùn)營(yíng)分公司人員編制擴(kuò)大到3000人。
運(yùn)營(yíng)分公司成立后首先接手運(yùn)營(yíng)的項(xiàng)目為南京地鐵一號(hào)線一期工程，主要負(fù)責(zé)地鐵一號(hào)線的運(yùn)營(yíng)工作，包括運(yùn)營(yíng)管理、列車(chē)運(yùn)行、控制監(jiān)督、員工培訓(xùn)及對(duì)土建設(shè)施、車(chē)輛和運(yùn)營(yíng)設(shè)備的保養(yǎng)、維修等。地鐵開(kāi)通后運(yùn)營(yíng)分公司直接面向市民，已成為南京地鐵與市民直接交流的一個(gè)重要窗口。
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